松弛素/内皮素-1平衡漂移对系统性硬皮病纤维化的作用及其机制研究

【摘要】第一部分系统性硬皮病患者外周血松弛素/内皮素-1漂移的研究目的：检测系统性硬皮病(systemicscleroderma,SSc)患者外周血松弛素(relaxin,RLN)和内皮素-1(endotheline-1,ET-1)的浓度,探讨二者浓度变化与SSc患者疾病特征的联系。方法：入组门诊或住院SSc患者51人(年龄范围为19-75岁),同时入组与SSc患者性别相同、年龄相似的健康志愿者51人作对照。SSc患者分为局限皮肤型和弥漫皮肤型两种亚型。观察指标主要包括血清ET-1和RLN的浓度、内脏受累情况、抗核抗体(ANA)和抗-Scl-70抗体。血清RLN和ET-1的浓度采用ELISA法检测。采用单因素或双因素方差分析(多重比较采用Bonferroni’spost-t检验)、多变量方差分析和logistic回归分析进行统计检验。结果：相对于健康对照者,SSc患者血清ET-1和RLN的浓度均显著升高(P<0.001)。多变量方差分析显示,SSc分别与血清RLN浓度和血清ET-1浓度之间的相关性存在显著差别(P<0.001)；logistic回归分析(预测模型)显示,对于预测SSc,血清RLN浓度的OR值(1.165,95%confidenceinterval1.097-1.264)高于血清ET-1浓度的OR值(1.061,95%confidenceinterval1.034-1.095)。与育龄女性相比,男性和绝经女性患者血清ET-1浓度增加(P<0.01)而血清RLN浓度降低(P<0.05)。有内脏受累的SSc患者血清ET-1浓度高于无内脏受累的SSc患者(P<0.001)；血清RLN浓度与SSc患者内脏受累与否无显著的相关性(P>0.05)。血清ET-1和RLN浓度与SSc临床亚型、ANA及抗Scl-70抗体之间无显著的相关性(P>0.05)。结论：SSc患者外周血ET-1和RLN的浓度高于正常人,且外周血ET-1和RLN的浓度随性别、女性生理期(育龄或绝经)的变化而改变。与血清ET-1浓度相比,血清RLN浓度对患SSc有更好的预测价值,但SSc患者血清ET-1水平升高可能提示内脏受累。第二部分松弛素/内皮素-1漂移对系统性硬皮病患者成纤维细胞增殖、活化表型和胶原合成/降解代谢的影响目的：研究松弛素(relaxin,RLN)/内皮素-1(endotheline-1,ET-1)漂移对系统性硬皮病(systemicscleroderma,SSc)患者皮肤成纤维细胞的增殖、活化表型的表达和胶原合成/降解代谢的影响。方法：局麻下切取SSc患者皮损和正常人皮肤,进行成纤维细胞原代培养并传代。取第3-6代细胞,以单用ET-1(0.25mg/L)或联用ET-1(0.25mg/L)和RLN(1μg/L、10μg/L或100μg/L)的方式进行干预。采用噻唑兰(MTT)法测定细胞增殖；采用免疫组织化学法检测成纤维细胞活化表型——α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达水平；采用实时定量聚合酶链反应(PCR)法检测Ⅰ型前胶原al链(COL1A1)/COL3A1及基质金属蛋白酶-1(MMP-1)及其组织抑制剂(TIMP)-1mRNA的表达水平。结果：ET-1(0.25mg/L)促进SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞增殖和α-SMA的表达(P<0.05或P<0.01)。RLN(1μg/L、10μg/L和100μg/L)抑制ET-1对SSc和正常人成纤维细胞的促增殖作用(P<0.05或P<0.01)和促α-SMA表达的作用(P<0.05或P<0.01),且该抑制作用随RLN浓度的升高而增强。ET-1(0.25mg/L)促进SSc患者和正常人皮肤成纤维细胞COL1A1,COL3A1和TIMP-1mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)并抑制MMP-1mRNA的表达(SSc成纤维细胞P<0.05,正常人成纤维细胞P<0.01)。RLN抑制ET-1的上述效应(P<0.05或P<0.01),且该抑制作用多随RLN浓度升高而增强。结论：在体外,ET-1促进SSc皮肤成纤维细胞的增殖并上调其活化表型a-SMA及胶原的表达；RLN呈浓度依赖性地抑制ET-1的上述效应。第三部分松弛素／内皮素-1与硬皮病小鼠器官纤维化的联系及其机制探讨目的：研究松弛素(relaxin,RLN)和内皮素-1(endotheline-1,ET-1)漂移与系统性硬皮病(systemicscleroderma,SSc)小鼠模型器官纤维化的联系及其可能的机制。方法：对C3H/He小鼠皮下注射博来霉素(Bleomycin,BLM)每日1次、连续3周,复制硬皮病小鼠模型,并以同样方法注射磷酸盐缓冲液(PBS)为对照。在开始注射BLM的首日,在小鼠肩胛部皮下置入微量渗透泵,缓释RLN(0.5mg/kg/d)共2周,并以同样方法缓释其溶剂醋酸钠(NaAc)溶液作为对照。分别于开始BLM注射后第1、2、3、5、7周末采集小鼠血浆,采用ELISA法检测ET-1浓度；取小鼠注射部位皮肤及肺组织,采用HE及Masson三色染色进行组织学检查,采用实时定量PCR法检测皮肤和肺ET-1、Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)mRNA的表达。结果：造模第3周末,与PBS组相比,BLM组小鼠真皮厚度和肺组织纤维化百分比显著升高(P<0.05,p<0.001),皮肤COL1A1mRNA表达呈时间依赖性地升高(第3周末,P<0.05；第5周末和第7周末,P<0.01),肺COL1A1mRNA则在第2周末和第3周末显著升高(P<0.001)。造模第3周末,与BLM+NaAc组相比,BLM+RLN组小鼠皮肤厚度和肺纤维化百分比显著降低(P<0.05,P<0.01),皮肤COL1A1mRNA表达呈时间依赖性地降低(第2周末、第3周末和第5周末,P<0.05；第7周末,P<0.01),肺COL1A1mRNA则在第2周末和第3周末显著降低(P<0.001,P<0.01)。造模第1周末,BLM组小鼠血浆ET-1水平显著高于PBS组,BLM+RLN组小鼠血浆ET-1水平明显低于BLM+NaAc组(P<0.01),此后其各自组间均无显著差别。BLM组小鼠皮肤ET-1mRNA的表达显著高于PBS组(第1周末P<0.01,第5周末和第7周末,P<0.05),BLM+RLN组小鼠皮肤ET-1mRNA的表达显著低于BLM+NaAc组(第1周末P<0.01,第7周末P<0.05)。造模第1周末,BLM组小鼠肺ET-1mRNA的表达高于PBS组(P<0.01),此后两组无显著差别。BLM+RLN组小鼠肺ET-1mRNA的表达显著低于BLM+NaAc组(P<0.01,P<0.05)。结论：RLN下调SSc小鼠外周血ET-1水平及皮肤和肺ET-1mRNA的表达,这可能在RLN的抗SSc纤维化效应中起重要作用。
【作者】宋应华；
【导师】李明；
【作者基本信息】复旦大学，皮肤病与性病学，2013，博士
【关键词】系统性硬皮病；成纤维细胞；内皮素-1；松弛素；胶原；

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